Николай Петрович Лихачёв из потомственных дворян Казанской губернии. Сын штабс-ротмистра Петра Фёдоровича Лихачёва и Клавдии Петровны Андреевой. В 1880 году с золотой медалью окончил 2-ю Казанскую гимназию и поступил на историко-филологический факультет Казанского университета. По окончании курса со степенью кандидата в 1884 году был оставлен при университете для подготовки к профессорскому званию по кафедре русской истории.

С 1892 года преподавал в Петербургском археологическом институте, где основал кафедру дипломатики. С 1894 года — член Археографической комиссии. В 1902—1914 годах — помощник директора Императорской публичной библиотеки. В библиотеке углубленно занимался библиографией, изучением литературы по альдам, эльзевирам, инкунабулам, историей письменности, прессы, переплётов, летучих изданий, автографов. Неоднократно бывал в заграничных поездках с целью изучения постановки библиотечного дела в Европе. Разрабатывал вопросы комплектования, способствовал пополнению фондов библиотеки отсутствующими изданиями, участвовал в работах по обоснованию расширения штатов библиотеки и совершенствования их структуры, выступал за поднятие научного престижа и статуса библиотекарей.

С 1907 года — действительный статский советник. В 1914—1917 годах — член совета министра народного просвещения. Стоял у истоков черносотенного движения, 16 января 1901 года участвовал в учредительном собрании старейшего монархического объединения России — «Русского собрания», вместе с Алексеем Сувориным, Константином Гротом, Никодимом Кондаковым и другими.

Собрал уникальные коллекции русских, восточных и западноевропейских рукописей, монет (15000 единиц), византийских и русских печатей VI—XIV вв. (около 6000 единиц), икон (около 1500 досок; коллекция икон в 1913 куплена императором Николаем II и поступила в Русский музей), хранившиеся в специально построенном собственном доме, где он жил в 1902—1936 годах (Петрозаводская улица, 7, ныне здание Санкт-Петербургского института истории РАН). Стремясь спасти своё собрание, передал его в 1918 Петроградскому археологическому институту, где был создан Палеографичический кабинет, преобразованный в 1925 в Музей палеографии АН СССР, с 1930 — Музей книги, документа, письма АН СССР.

В 1930 году Н.П. Лихачёв был арестован по «Академическому делу», в 1931—1933 годах находился в ссылке в Астрахани. Его коллекции были конфискованы и переданы в Государственный Эрмитаж, Русский музей, Библиотеку Академии наук и другие хранилища. После возвращения из ссылки ютился с семьей в комнатах третьего этажа, пользуясь черной лестницей.

Скончался в 1936 году. Похоронен на Смоленском православном кладбище.

К 150-летию учёного Государственный Эрмитаж организовал выставку «Звучат лишь письмена…», в экспозиции которой были представлены письменные памятники из собрания академика Лихачёва: клинописные таблички Месопотамии, древнеегипетские надписи на камне; памятники Древней Греции и Рима; папирусы; византийские, древнерусские, сирийские, западные средневековые рукописи и грамоты, арабские надгробия, летучие издания России и Западной Европы, документы Ирана и Турции XV—XIX вв., печати, монеты, автографы, первопечатные книги и многое другое.

Санкт-Петербургским институтом истории РАН и Институтом археологии РАН учреждена премия памяти Н.П. Лихачёва.