Родился 30 июля 1889 года в имении Софиевка Киевской губернии. После смерти отца жил с матерью в Киеве, где учился в 1-й Киевской гимназии, с 1908 года — в Санкт-Петербурге. В 1909 году экстерном окончил Введенскую гимназию на улице Шамшева, в 1915 — историко-филологический факультет Петроградского университета, где его учителем был И.М. Гревс. После окончания университета Анциферов был оставлен при кафедре всеобщей истории, где находился до 1919 года.

Его педагогическая деятельность началась сразу после окончания университета: женская гимназия Н.Н. Зворской (1915—1916), частное реальное училище А.С. Черняева (1915—1918), школа при бывшем Тенишевском училище (1918—1925), 2-й Педагогический институт (1919—1926), интернат для беспризорных под Павловском (1919—1920), Институт истории искусств (1925—1929).

В 1914 году женился на Т.Н. Оберучевой. В 1915 году родилась дочь Наталия, в 1918 — сын Павел, в 1921 — сын Сергей, в 1924 — дочь Татьяна. Дети Наталия и Павел умерли в 1924 году от скарлатины. Сын Сергей умер в 42 году в Ленинграде от голода. Дочь Татьяна была угнана в Германию, жила до 2013 года. Жена умерла от туберкулеза в 1929 году.

Руководил семинарами по изучению Петербурга и Павловска, выступал с докладами и лекциями, водил экскурсии по городу и пригородам, сотрудничал в журналах «Педагогическая мысль» и «Экскурсионное дело». В открытом в 1921 году, по инициативе И.М. Гревса, Петроградском научно-исследовательском экскурсионном институте Анциферов участвовал в работе исторической и методической секций, вёл семинарии. После ликвидации Экскурсионного института в сентябре 1924 года перешёл в Петроградское отделение Центрального бюро краеведения (ЦБК).

Участвовал в религиозно-философских кружках А.А. Мейера «Вторник» и «Воскресенье» (1918—1925).

Весной 1925 года Анциферов арестован, приговорен к 3 годам ссылки и отправлен в Омск. Через три месяца освобожден и вернулся в Ленинград. В ночь на 23 апреля 1929 года арестован как участник "контрреволюционной монархической организации «Воскресенье»". 22 июля 1929 года Николай Анциферов приговорен к 3 годам ИТЛ и в августе отправлен в Соловецкий лагерь особого назначения.

3 мая 1930 года Николай Павлович Анциферов был арестован в лагере как «участник контрреволюционной организации», отправлен в изолятор на Секирной Горе на Соловках, затем — для дальнейшего следствия в Ленинград. 20 июня лагерный срок был увеличен на один год, и его вернули на Соловки. Летом 1930 года был отправлен в Ленинград и привлечен к следствию «по делу Академии наук». 23 августа 1931 года приговорен к 5 годам и отправлен в Беломорско-Балтийский ИТЛ. Осенью 1933 года освобожден и вернулся в Ленинград.

В сентябре 1937 года снова арестован, 20 декабря приговорен к 8 годам ИТЛ и отправлен в Байкало-Амурский исправительно-трудовой лагерь. 2 декабря 1939 года освобожден из лагеря, дело от 29 октября 1929 года прекращено по пересмотру.

Был принят в Союз писателей в 1943 году. В 1944 защитил диссертацию на тему «Проблема урбанизма в художественной литературе». В работах по истории города Анциферов выступил основоположником комплексного («цельнокупного») метода изучения городской среды, особое внимание уделял взаимовлиянию исторической среды и культурной жизни города. Через всё творчество Анциферова проходит представление о городе как «выразителе сменяющихся культур», как «едином социальном организме».

Анциферов — автор работ по истории Санкт-Петербурга, методике и организации экскурсионного дела, мемуаров «Из дум о былом». В 1989 году в Ленинграде состоялись «Анциферовские чтения», в 1995 учреждена Анциферовская премия за лучшие современные работы по истории города. Московские «Анциферовские чтения» состоялись в сентябре 2012 года.

Анциферов, Николай. Душа Петербурга : очерки. - Санкт-Петербург : ЛИРА, 1990. - 256 с.

Анциферов, Николай. Душа Петербурга: публикация забытых и редких книг по истории, культуре, архитектуре и быту города. Вып. 1 / Н. П. Анциферов. - Переиздание книги издательства Брокгауз и Ефрон 1922 года. - Ленинград : Товарищество Свеча, 1990. - 144 с. : ил. - (Ленинград весь на ладони) (Петербургская антология).